原代细胞的培养

简介：脂肪前体前细胞与其他成体干细胞一样，具有自我更新、活力持久及多向分化潜能。大量实验证明在合适的诱导条件下，脂肪前体细胞可分化为成熟的脂肪细胞。其在抗衰老，美容等方面应用广泛。

原理：脂肪前体细胞的传统提取方法主要是酶消化法，原理是利用胶原酶消化脂肪组织中的胶原组织，使细胞松散，便于脱落，再通过过滤、洗涤和离心等步骤去除漂浮在上层的脂肪细胞和油脂，从而得到脂肪干细胞。

方法：

脂肪组织SVF的提取

• 收集脂肪组织，用预冷的PBS冲洗3遍，剪去血管、筋膜；
• 纱布蘸干脂肪组织，放入玻璃皿中，用剪刀将脂肪组织剪碎；
• 在脂肪糜中加入两倍体积的消化液（Collegenase, type I 2 mg/mL + BSA 5 mg/mL + CaCl2 1.11 mg/mL），混匀后转移至50 mL离心管，37 ℃，200 rpm，摇床摇40分钟，观察混合液状态，待其无明显颗粒状时拿出；
• 用含10% BSA的PBS溶液终止反应，用70 μm的细胞滤网过滤，滤出液即为细胞悬液。将细胞悬液400 g，4 ℃，5分钟离心，取细胞沉淀；
• 向细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解3分钟后，加入3倍体积PBS终止反应。400 g，5分钟离心取细胞沉淀，细胞沉淀即脂肪组织中SVF。

分离SVF中APCs

• 适量SVF按比例加入流式buffer 、CD45 MicroBeads和CD31 MicroBeads，鼠的SVF加入Nonadipose Tissue Progenitor MicroBeads，混合均匀，冰上避光孵育30分钟；
• 2 mL流式buffer终止反应，取磁珠分选出的阴性细胞，300 g，4 ℃离心10分钟后弃上清，用90 μL 流式buffer重悬，人SVF加入10 μL CD34 MicroBeads，鼠的SVF加入10 μL Adipose Tissue Progenitor MicroBeads，冰上避光孵育30分钟;
• 2 mL流式buffer终止反应，取磁珠分选出的阳性细胞，300 g，4 ℃离心10分钟后弃上清，沉淀即为APCs；
• 用含10% FBS(无外泌体) 和100 U/mL双抗的高糖DMEM培养基，将细胞继续培养、扩增。

APCs细胞培养与传代

• 用完全培养基重悬磁珠分选出的APCs，种植于24孔板上，48小时后换液；
• 待细胞长至80%-90%时传代，用移液器吸弃细胞培养基，用无菌PBS溶液润洗一遍；
• 用1 mL胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察细胞消化好后加入3 mL完全培养基终止反应，用移液枪吸取液体转移至15 mL无菌离心管中，300 g，离心5分钟；
• 弃上清，用完全培养基将细胞沉淀吹打成均一的细胞悬液，种植于新的培养皿上。

图示：3个月小鼠脂肪前体细胞（4倍，10倍）