细胞凋亡实验

简介：

细胞凋亡或称程序性细胞死亡( Programmed Cell Death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学过程。它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋广过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

原理：

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，细胞核染料（PI,DAPI,7-AAD）可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，细胞核染料（DAPI、PI、7-AAD）可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。是目前最为理想的凋亡定量检测方法

实验仪器及材料准备：

凋亡试剂盒，PBS，流式管，流式仪

实验方法：

1.1 样品染色

1. 悬浮细胞：300 g，4 ℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4 ℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

2. 用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300 g，4 ℃离心5 min。

3. 吸弃PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。

4. 加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488/647和10 μL PI，轻轻混匀。

5. 避光、室温反应10-15 min。

6. 加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

【注】：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

1.2 流式细胞仪分析

Alexa Fluor488最大激发波长为488 nm，最大发射波长为519 nm；Alexa Fluor647最大激发波长为651 nm，最大发射波长为667 nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm。用flowjo等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），Alexa Fluor488 /Alexa Fluor647为横坐标，PI为纵坐标。

实验结果：